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在探索生命奧秘的征途上，蛋白質(zhì)-相互作用（PPI）的研究至關(guān)重要。傳統(tǒng)的BRET（生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移）技術(shù)曾是研究細(xì)胞動(dòng)態(tài)事件的有力工具，但其應(yīng)用卻常常受限。
生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）檢測(cè)試劑盒由Promega在20世紀(jì)90年代末開(kāi)發(fā)，對(duì)于理解細(xì)胞動(dòng)態(tài)事件至關(guān)重要，特別是蛋白相互作用（PPI）。在BRET中，發(fā)光供體的激發(fā)態(tài)能量可以轉(zhuǎn)移到受體熒光素，導(dǎo)致受體分子以特征發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)出。這些類(lèi)型的檢測(cè)試劑盒迅速成為測(cè)量PPI的有用工具，它們不僅被認(rèn)為是通用的、快速的和生物學(xué)上有用的，而且也適合用于PPI調(diào)節(jié)的活細(xì)胞藥物發(fā)現(xiàn)的高通量篩選。然而，傳統(tǒng)的BRET技術(shù)存在一些局限性：
Promega公司推出的NanoBRET?消除了所有的限制。在NanoBRET?中，可以使用一種新的、效率高得多的供體-受體對(duì)來(lái)研究PPI（見(jiàn)圖1）。這一新組合包括一個(gè)非常亮的熒光素酶（NanoLuc）作為能量供體，以及一個(gè)用熒光標(biāo)記的Halotag融合蛋白作為能量受體。 圖 1. NanoBRET?檢測(cè) A中：使用NanoBRET研究蛋?質(zhì)A和B之間的相互作用。供體是NanoLuc??蛋?質(zhì)A融合體，受體是熒光標(biāo)記的HaloTag??蛋?質(zhì)B融合體。 B中：顯示了NanoBRET的分離光譜和計(jì)算方法。 新的供體（NanoLuc）尺寸小（19kD），發(fā)射信號(hào)強(qiáng)（460nm發(fā)射峰），并且發(fā)射光譜較窄，降低了供體信號(hào)“溢漏”到受體發(fā)射通道的可能性。 選擇紅色熒光素酶作為BRET配體 (618nm發(fā)射) 通過(guò)共價(jià)鍵連接到HaloTag，這允許相當(dāng)大的光譜分離（超過(guò)150nm），從而確保非常高的信噪比。 然而，盡管比典型的BRET檢測(cè)方法優(yōu)越，NanoBRET的性能仍然取決于選擇合適的酶標(biāo)儀。Promega強(qiáng)烈建議使用能夠測(cè)量雙濾光片波長(zhǎng)的儀器，Thermo Scientific Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀具備測(cè)量雙濾光片波長(zhǎng)的能力，非常適合進(jìn)行NanoBRET?檢測(cè)。 選擇次優(yōu)濾光片可能會(huì)損害試驗(yàn)性能并降低數(shù)據(jù)質(zhì)量。根據(jù)Promega的說(shuō)法，理想情況下供體信號(hào)應(yīng)該用中心波長(zhǎng)為460nm的帶通濾光片（BP）和一個(gè)從600-610nm開(kāi)始的長(zhǎng)通濾光片（LP）來(lái)測(cè)量，以收集所有受體發(fā)射信號(hào)。使用適當(dāng)?shù)腖P濾光片收集受體信號(hào)對(duì)于確保檢測(cè)試劑的靈敏度尤為重要。 96孔板和384孔板，1X PBS/0.1%BSA，NanoBRET?控制蛋白組，NanoBRET? Nano-Glo?底物。 用1X PBS/0.1%BSA稀釋NanoBRET Nano-Glo底物，稀釋250倍制備成2X溶液。將不同濃度的反應(yīng)液每孔加50μl，并加入等量的2X NanoBRET Nano-Glo底物 (50μl)。最后一種試劑用Varioskan LUX添加。在加入底物后10分鐘內(nèi)，使用Varioskan LUX和選擇的濾光片檢測(cè)供體和受體發(fā)射光信號(hào)。 儀器啟動(dòng)前，需要安裝適當(dāng)?shù)臑V光片。為此，請(qǐng)按照儀器手冊(cè)中的說(shuō)明將濾光片安裝到Varioskan LUX中。需要注意的是，在安裝F600LP或F610LP濾光片時(shí)，即使這些濾光片沒(méi)有波長(zhǎng)范圍，也必須在Thermo Scientific SkanIt?軟件中定義一個(gè)波長(zhǎng)范圍，可以設(shè)置600-999nm。 添加一個(gè)動(dòng)力學(xué)環(huán)，選擇總時(shí)間（或讀數(shù)次數(shù)）和動(dòng)力學(xué)間隔。在此測(cè)試中，以1分鐘為間隔進(jìn)行20次讀數(shù)。注意：反應(yīng)開(kāi)始后的前10分鐘內(nèi)，受體和供體發(fā)射信號(hào)的動(dòng)力學(xué)衰減非常顯著（如圖2所示）。然而，供體和受體信號(hào)的衰減速度保持不變，因此在較長(zhǎng)的測(cè)量時(shí)間內(nèi)計(jì)算出的NanoBRET比值不會(huì)受到影響。 圖2 在本次案例中，在讀數(shù)為1時(shí)用中高速自動(dòng)分液50μl NanoBRET Nano-Glo底物。 選擇用于測(cè)量NanoBRET的濾光片對(duì)，并設(shè)置1000毫秒的測(cè)量時(shí)間，使用自動(dòng)增益。 注意：通常情況下，改變?cè)鲆嬉栽鰪?qiáng)受體發(fā)射信號(hào)并不能改善NanoBRET結(jié)果（改變?cè)鲆鏁?huì)同時(shí)放大信號(hào)和背景噪聲）。然而，在受體發(fā)射信號(hào)飽和的情況下，可以降低增益以獲得非飽和讀數(shù)。 在0%濃度（沒(méi)有nanoBRET信號(hào)）和100%濃度（最大nanoBRET信號(hào)）的孔中測(cè)量受體和發(fā)射光譜。使用波長(zhǎng)范圍為400–700nm（以1nm步進(jìn)），測(cè)量時(shí)間為100ms。 通過(guò)將受體發(fā)射信號(hào)值除以供體發(fā)射信號(hào)值（Acceptor Em/Donor Em）來(lái)計(jì)算每個(gè)樣本的NanoBRET比值。 通過(guò)從樣品中減去對(duì)照（無(wú)相互作用）的NanoBRET比值來(lái)計(jì)算校正后的NanoBRET比值。 對(duì)校正后的 NanoBRET 比值與濃度的依賴(lài)關(guān)系進(jìn)行線性回歸分析，并計(jì)算曲線的斜率。 如果儀器正確地檢測(cè)到NanoBRET信號(hào)，應(yīng)該獲得一條線性曲線。使用以下公式計(jì)算定量限（LOQ）和檢測(cè)限（LOD）。注意：無(wú)相互作用對(duì)照（下圖）對(duì)應(yīng)于0%濃度樣本。 使用NanoBRET比值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)計(jì)算每個(gè)濃度篩選窗口系數(shù)值（Z’）以評(píng)估該檢測(cè)方法在各個(gè)濃度下的性能： 使用Promega控制蛋白組進(jìn)行的NanoBRET檢測(cè)顯示，在96孔板中，使用兩種不同的發(fā)射濾光片收集受體信號(hào)時(shí)，Varioskan LUX 檢測(cè)到的NanoBRET信號(hào)保持線性（圖3）。 圖3 當(dāng)使用波長(zhǎng)為600或610nm濾光片收集受體信號(hào)時(shí)，儀器性能指標(biāo)LOQ和LOD值也高度相似（表1）。使用Varioskan LUX，兩種情況下的LOQ濃度都在0.2%左右，表明相對(duì)于總供體群體，含有0.2%供體受體（BRET）對(duì)的樣本從統(tǒng)計(jì)上與只含有供體分子的樣本區(qū)分開(kāi)來(lái)。 NanoBRET是一種出色的篩選工具。根據(jù)這里獲得的結(jié)果，還可以得出結(jié)論：在1%最大NanoBRET效率下進(jìn)行篩選優(yōu)化，無(wú)論Varioskan LUX測(cè)量時(shí)采用哪個(gè)NanoBRET受體發(fā)射濾光片（600或610nm），都可以產(chǎn)生極好的質(zhì)量參數(shù)（Z' > 0.8）。 當(dāng)在384孔板中運(yùn)行時(shí)，該分析方法也表現(xiàn)良好。在這種情況下測(cè)量的最低檢出限 (LOD) 只輕微增加到0.35%(圖4)。這使得NanoBRET和Varioskan LUX的結(jié)合對(duì)于大型化學(xué)抑制劑篩選受體供體對(duì)的檢測(cè)非常有用。 圖4 在Varioskan LUX中選擇多重化學(xué)發(fā)光檢測(cè)濾光片，可實(shí)現(xiàn)NanoBRET 的性能，這是一種由Promega開(kāi)發(fā)的技術(shù)，非常適合對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。我們建議使用中心波長(zhǎng)約為460nm（發(fā)射波長(zhǎng)為450nm，帶寬為80nm）的帶通 (BP) 濾光片測(cè)量供體發(fā)射信號(hào)，使用起始波長(zhǎng)為600或610nm的長(zhǎng)通 (LP) 濾光片測(cè)量受體發(fā)射信號(hào)。
